Kromatin immünopresipitasyon

Kromatin immüno- bağlanma siteleri saptanması için bir yöntem olup , DNA üzerindeki genom belirli bir protein için ve yer alan protein-DNA etkileşim bir temsili erişim sağlayan göbek bir canlı hücrenin veya dokularda. Bu yöntemin in vivo uygulaması , genel olarak kullanılanlardan çok farklıdır.

Prensip

Bu sürecin arkasındaki ilke, DNA'ya bağlanan proteinlerin ( transkripsiyon faktörleri ve histonlar dahil ) bağlı oldukları DNA ile çapraz bağlanabilmesidir. DNA'ya bağlı olduğundan şüphelenilen bir proteine ​​özgü bir antikor kullanılarak, hücre lizatının protein - DNA kompleksini immüno-çökeltilebilir. Çapraz bağlanma genellikle formaldehitin hücreler (veya dokular) üzerindeki etkisiyle elde edilir , ancak bazen DTBP ( di -tert-butil peroksit ) gibi daha uygun bir reaktif kullanmak daha avantajlıdır . Çapraz bağlamadan sonra hücreler lize edilir ve DNA bir ultrason banyosu kullanılarak 0.2-1 kb ( kilobaz ) uzunluğunda parçalara bölünür  . Bu noktada, saflaştırılmış protein - DNA kompleksleri elde etmek için immünopresipitasyon gerçekleştirilir. Bu saflaştırılmış kompleksler daha sonra formaldehit ile çapraz bağlanmayı iptal etmek için ısıtılır ve DNA proteinlerden ayrılabilir. DNA fragmanlarının tanımlanması ve numaralandırılması, polimeraz zincir reaksiyonu ( PCR ) ile elde edilebilir . Kullanılarak sınırlamaları bir PCR izole fragmanları on tarafından doğru primerler elde edebilmek amacıyla, hedef olmuştur genomunun bölgesinde bir fikir sahibi olmak zorunda olmasıdır PCR . Bu sınırlama, kolayca üstesinden gelinmiş olunmaktadır klonlama bir izole edilmiş genom DNA plazmid vektörü bu vektörün klonlama bölgesi için primerler spesifik kullanarak ve daha sonra. Öte yandan, proteinin büyük ölçekli bir genomda nereye bağlandığını belirlemek istediğimizde, bir DNA çipi ( çip üzerinde çip ) veya yüksek verimli dizileme ( Chip-Seq ) kullanabiliriz. sistrom . Yonga-dizileme , çok maliyet açısından oldukça ekonomiktir yüksek oranda bağlanma yerleri bulmak için kullanılan yeni bir teknolojidir.

Tarihi

Chromatin immünopresipitasyon, 1984 yılında John T. Lis ve David Gilmour tarafından, canlı bakteri hücrelerinde DNA ile ve DNA ile temas halindeki proteinler arasında çapraz bağlantılar veya kovalent bağlar oluşturmak için UV ışınları kullanılarak oluşturuldu. Çapraz bağlı hücrelerin lizisini ve bakteriyel RNA polimerazın immünopresipitasyonunu takiben, onunla bağlantılı DNA, in vivo dağılımını ve RNA polimeraz yoğunluğunu belirlemek için bilinen genlerin farklı bölgelerine karşılık gelen problara hibridize edildi. bu genler. Bir yıl sonra, ökaryotik RNA polimerazın Drosophila'daki ısı şoku genleri üzerindeki dağılımını tanımlamak için aynı metodolojiyi kullandılar. Bu çalışmalar, kromatin immünopresipitasyon alanında öncü çalışma olarak düşünülebilir.

Notlar ve referanslar

1. çip-dizileme DNA ile protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılır. Bu teknik, proteinlerin DNA ile ilişkili olduğu siteleri belirlemek için kromatin immünopresipitasyonunu DNA dizilimi ile birleştirir . (tr) İngilizce Wikipedia'daki makaleyi okuyabilirsiniz: Chip - Sequencing (en) .  
2. [1]
3. [2]