Genetik mühendisliği , çıkarma sokulması ya da değiştirilmesi ile bir organizmanın genetik yapısını değiştirmek için araçlar kümesidir DNA .
Bu, doğrudan doğruya sokulabilir hücrelerin konakçı organizmanın ya da kültürlenen hücrelere ex vivo olarak ve daha sonra organizmaya tekrar verilmişse. Genetik mühendisliğinin geliştirilmesi için bir ön koşul , kalıtımsal genetik materyalin yeni kombinasyonlarını oluşturmak için rekombinant nükleik asit tekniklerinin geliştirilmesi ve ardından bu materyalin bir vektör sistemi yoluyla dolaylı olarak veya doğrudan mikro enjeksiyon, makro enjeksiyon veya mikro kapsülleme.
Genellikle genotipleri ve dolayısıyla fenotipleri değiştirmeyi amaçlar .
Genetik mühendisliği çok aktif bir araştırma alanıdır çünkü olası uygulamalar, özellikle insan sağlığında ( zararlı bir mutasyon taşıyan bir genin düzeltilmesi , terapötik proteinlerin üretilmesi , kalıcı viral sekansların ortadan kaldırılması vb.), Biyoteknolojik tarımda ( yeni nesil genetiği değiştirilmiş bitkilerin geliştirilmesi , vb.) veya hatta araştırma amaçlı araçların geliştirilmesi için (örneğin bir genin işlevini keşfetmek için).
Genetik mühendisliğinin katlanarak gelişmesinin ardından, 1960'larda yeni bir disiplin ortaya çıktı , biyoetik , araştırmacılar ve aynı zamanda politikacılar ve kamuoyunu sistematik olarak mümkün olan en kısa sürede etik bir boyut getirme ihtiyacına duyarlı hale getirmeyi amaçladı . ihtiyat ilkesi ).
20. yüzyılın başında Mendel'in (1822-1888) çalışmasının yeniden keşfi ve Morgan'ın (1866-1945) Drosophila sineği üzerindeki çalışması, kalıtımın gen adı verilen parçacıkların aktarımından kaynaklandığını anlamayı mümkün kıldı. , kromozomlar üzerinde doğrusal olarak düzenlenmiştir . 1950'lerde, genlerin kimyasal yapısı ve DNA'nın moleküler yapısı gün ışığına çıkarıldı . Gelen 1965 , keşif kısıtlama enzimlerinin teyit 1973 tarafından Paul Berg ve arkadaşları. DNA'yı kesin olarak kesip yeniden yapıştırabilen bu proteinler, araştırmacılara genomu haritalamak için sahip olmadıkları araçları sağlıyor . Ayrıca , DNA bölümlerine ve dolayısıyla genlere in vitro müdahale etmeyi mümkün kılan transgeneze giden yolu açar . Teknoloji rekombinant DNA bir kısmının sokulmasına izin veren DNA birbirinin içine (bir ya da daha fazla gen) DNA .
Bazı organizmalarda, bir genin canlı hücreye sokulması için geliştirilen teknolojiler, yeni dizinin genoma eklenmesinin rastgele doğası ile sınırlı kalır. Rastgele yerleştirilen yeni gen, üçüncü taraf genlerin işleyişini etkisiz hale getirebilir veya bozabilir veya hatta bir kanserleşme sürecini tetiklemek gibi ciddi istenmeyen etkilerin nedeni olabilir. Hedefli olmayan ekleme teknolojileri, deneyin tekrarlanabilirliğinin elde edilmesine izin vermez: yeni dizinin her zaman aynı yere ekleneceğine dair hiçbir garanti yoktur.
1990'ların sonundan bu yana, yeni nesil teknolojiler, programlanabilir nükleazlar (ZNF'ler, TALEN'ler ve CRISPR) gibi daha yeni bilgi ve teknolojilerden yararlanmaktadır. Gerçekleştirilen düzeltme veya yerleştirmenin hassasiyetini artırmak için DNA'nın belirli bir alanına müdahale etmeyi mümkün kılarlar, böylece hücresel toksisiteleri önler ve müdahalenin güvenilir bir şekilde tekrarlanabilirliğini sağlarlar.
Bu yeni genomik mühendislik teknolojileri, sentetik genomik (yapay genom tasarımı) ile birlikte şu anda uygulamalı biyolojik araştırma ve endüstriyel yenilik açısından en umut verici teknolojiler arasındadır.
GDO'ların üretimi, canlı bir varlığın genomuna yeni genlerin, DNA'nın kısımlarını yerleştirerek veya mevcut belirli genleri silmeyi veya değiştirmeyi mümkün kılar . Bu modifikasyonlar, özellikle transgenez ve daha yakın zamanda programlanabilir nükleazlar (daha özel olarak CRISPR aracı ) olmak üzere çeşitli genetik mühendislik araçlarını kullanır .
Genetik mühendisliği majör biridir bilimsel gelişmeler arasında XX inci yüzyılın. Gerçekten de güçlü bir gelişme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, biyomedikal araştırmalarda sunduğu uygulama olanakları, umut kadar çok korku uyandırmaktadır. Bu nedenle 1960'larda , araştırmacıları olduğu kadar politikacıları ve halkı da araştırma aşamasından sistematik olarak bir etik boyut getirme ihtiyacına duyarlı hale getirmeyi amaçlayan yeni bir disiplin olan biyoetik ortaya çıktı .
2015 yılında Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Tıp Akademisi, organizatörler için daha önemli olan öjenik gibi genetik mühendisliğinin risklerine dikkat çekmek için uluslararası bir zirve düzenledi . Diğer bir risk, genetik mühendisliğinin etkilerinin belirsizliğidir: insan genomunun karmaşıklığı ve tüm farklı genler arasındaki karşılıklı bağımlılık göz önüne alındığında, tek bir genin modifikasyonu, genomun diğer kısımlarını da etkileyecektir. Ancak, Fransız kadın Emmanuelle Charpentier ve Amerikalı Jennifer Doudna tarafından 2012 yılında geliştirilen yeni bir tıbbi yenilik olan CRISPR-Cas9 teknolojisi sayesinde ilk kez Çin'de GDO'lu bebekler doğdu. Çinli araştırmacı He Jiankui, Lulu ve Nana'nın ikizlerinin HIV taşımasını önlemek için kullandı. Yeni Cas9 teknolojisi, belirli genlerin kesilmesine izin veriyor, ancak bu, canlı kalması amaçlanan embriyolar üzerinde hiçbir zaman denenmemişti.
Quebec'li biyolog Jean-François Gariépy, genetik mühendisliğinin mevcut insan üreme mekanizmalarının değiştirilmesine yol açabileceği konusunda uyarıyor. Monografie olarak devrimci fenotip ( devrimci fenotip ), Gariépy bazında bu teori , RNA, dünyanın varsayımı de RNA 'nın ile değiştirildi DNA dünya hakim çoğaltıcısı gibi. İnsanlık bu yolu seçerse, uzun vadede sonuç, genetik mühendisliği sürecini manipüle eden güçlerin çıkarlarına uygun olarak herhangi bir insan toplumunun radikal dönüşümü olacaktır.
Transgenez, bir organizmanın genomuna bir virüs veya bir bakteri aracılığıyla veya DNA'nın fizikokimyasal yöntemlerle (elektroporasyon, transfeksiyon veya mikro enjeksiyon) dahil edilmesiyle bir eksojen DNA'nın sokulmasından oluşur. İlk transgenik fare 1974 yılında biyolog Rudolf Jaenisch tarafından yaratıldı. İlk transgenik bitkiler 1984 yılında bir eksojen DNA vektörü olarak Agrobacterium tumefaciens kullanılarak yaratıldı . Transgenez yaklaşımlarının önemli bir sınırlaması, eksojen genetik materyalin rastgele yerleştirilmesidir. Ekleme, bir endojen genin yakınında gerçekleştiğinde, ikincisinin ekspresyonunda bir kusura yol açabilir.
Transgenezden farklı olarak, homolog rekombinasyon yaklaşımları, genetik materyalin çok hassas bir şekilde sokulmasına, çıkarılmasına veya değiştirilmesine izin verir. Bu yaklaşımlar, bir şablon olarak başka bir sarmalda bulunan homolog bir diziyi kullanarak hasarlı DNA'yı onarmak için hücrelerde doğal olarak bulunan bir mekanizmaya dayanmaktadır.
Örneğin bir retrovirüsün değiştirilmiş genomunu vektör olarak kullanarak, bir hücrenin doğal DNA'sı ile araştırmacılar tarafından tanıtılan bir eksojen DNA arasında homolog rekombinasyonları indüklemek mümkündür . Rekombinasyon olgusu yeterince esnektir, böylece hedeflenen homoloji bölgesi seviyesinde belirli bir seviyede değişiklik (DNA'nın bir kısmının eklenmesi, silinmesi veya modifikasyonu) dahil edilmesi mümkündür.
1980'lerin başlarında, Mario R. Capecchi ve Oliver Smithies, homolog DNA rekombinasyonu üzerinde bir "gen hedefleme" aracı, yani belirli genleri etkisiz hale getirmek veya değiştirmek için bir araç olarak çalıştılar. Martin J. Evans'ın işbirliği ile, fare embriyonik kök hücrelerinin DNA'sını kültürde modifiye ederek ve bu modifiye edilmiş kök hücreleri fare embriyolarına enjekte ederek farelerin genomunu modifiye etmek için bir yöntem geliştirdiler . Bu şekilde üretilen genetiği değiştirilmiş fareler, laboratuvarda insan hastalıklarını incelemeyi mümkün kılıyor. Artık tıbbi araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Üç araştırmacının çalışmaları, onlara 2007'de Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nü kazandırdı .
Homolog rekombinasyon yoluyla genetik modifikasyon yaklaşımının önemli bir sınırlaması, istisna olan maya ve fare embriyonik kök hücreleri dışında çok düşük spontan aktivitesidir. Bu, uygulamasını diğer kuruluşlara ciddi şekilde sınırladı. Bununla birlikte, 1990'ların ortalarında, Maria Jasin ve Jean-François Nicolas'ın ekipleri, memeli hücrelerinin DNA'sındaki çift sarmallı bir kırılmanın, homolog rekombinasyonu (hücre tarafından kırılmayı onarmak için kullanılan) çok güçlü bir şekilde uyardığını gösterdi. Ek olarak, onarımdan sonra DNA dizilerinin analizi, küçük DNA dizilerinin (tipik olarak 1 ila 20 nükleotid uzunluğunda) silinmesine veya eklenmesine yol açan, homolog olmayan uçların birleşimi adı verilen ikinci bir DNA onarım yolunun etkisini gösterir . Bu gözlemler, bu nedenle araştırmacıları, hedef DNA dizisi programlanabilen nükleazlar (DNA'yı kesen enzimler) geliştirmeye yöneltmiştir.
Sınırlama enzim genellikle, 1 ila 10 nükleotitten oluşan bloklarla eksik DNA etkileşime moleküler biyolojide kullanılan. Çok kısa ve genellikle palindromik olan bu diziler genellikle genomun çeşitli yerlerinde bulunur ( insan genomu 6.4 milyar baz içerir). Bu nedenle kısıtlama enzimlerinin DNA molekülünü birçok kez kesmesi muhtemeldir.
Kesin ve güvenli genom ameliyatı gerçekleştirmek için bilim adamları bu nedenle daha hassas araçlara yöneldi. Hedeflenen genom mühendisliği, belirli bir genomdaki tek bir kopyada, her olasılıkla, var olmaya yetecek kadar uzun DNA dizilerini tanıyabilen ve onlarla etkileşime girebilen enzimlerin kullanılmasıyla mümkün hale gelir. DNA'ya müdahale daha sonra tam olarak hedeflenen sekans düzeyinde gerçekleşir. 12 baz çiftinden fazla tanıma bölgeleri ile meganükleazlar , çinko parmak nükleazları , TALEN'ler ve CRISPR sistemleri bu özgüllük kriterlerini karşılar.
DNA kesildikten sonra, doğal DNA onarım mekanizmaları ve homolog rekombinasyon, modifiye edilmiş bir sekansın veya yeni bir genin dahil edilmesini mümkün kılar.
Bu farklı adımların (tanıma, bölünme, rekombinasyon) başarısı, aralarında enzimi hücreye sokan vektörün verimliliği, enzimatik bölünme aktivitesi, homolog rekombinasyonun hücresel kapasiteleri ve muhtemelen durumu gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. kromatin de altında lokusu dikkate.
Meganükleazlar1980'lerin sonunda keşfedilen meganükleazlar , 12 ila 40 baz çifti arasında büyük DNA dizilerini tanıma özelliğine sahip endonükleaz ailesinden enzimlerdir . Bu meganükleazlar arasında, adlarını korunmuş bir amino asit sekansına borçlu olan LAGLIDADG grubunun proteinleri en çok sayıda ve en iyi bilinenlerdir.
Bu enzimler, 1990'ların başlarında genom mühendisliği için umut verici araçlar olarak tanımlandı. Bununla birlikte, doğadaki çeşitliliklerine ve her birinin DNA tanıma alanında küçük varyasyonlara sahip olabilmesine rağmen, iyi belirlenmiş bir DNA dizisine müdahale için uygun meganükleazı bulma şansı çok azdır. Bu nedenle, her yeni genom mühendisliği hedefi, kişiye özel bir meganükleaz üretmek için protein mühendisliğinin ilk aşamasını gerektirir.
Çinko parmak nükleazlarıNükleazlar çinko parmak enzimleri DNA'nın ayrılması ile çinko parmak etki alanları birleştirerek oluşturulan yapay kısıtlama.
Tanıma alanları karakterize edilmiş 6 ila 8 çinko parmağın kombinasyonu, yaklaşık yirmi baz çiftinden oluşan diziler için spesifik proteinler elde etmek mümkündür. Bu nedenle, belirli bir genin ekspresyonunu kontrol etmek mümkündür. Bu stratejinin hayvanlarda bir anjiyogenez sürecini teşvik etmeyi mümkün kıldığı gösterilmiştir . Hedeflenen DNA kırılmasına neden olmak ve bu proteinleri genom mühendisliği araçları olarak kullanmak için bu şekilde oluşturulan proteini bir endonükleazın katalitik alanıyla birleştirmek de mümkündür .
Çinko parmak nükleazları, özellikle Çinko Parmak Konsorsiyumu'nda federasyon olan laboratuarlar tarafından çeşitli genomları değiştirmek için zaten kullanılmış olan araştırma ve geliştirme araçlarıdır. Amerikan Sangamo Biosciences şirketi, kök hücrelerin genetik mühendisliği ve tedavi amaçlı bağışıklık hücrelerinin modifikasyonu üzerine çalışmak için çinko parmak nükleazları kullanıyor. Modifiye T lenfositleri şu anda, beyin kanserinin (glioblastoma) tedavisine ve AIDS ile mücadeleye odaklanan, faz I klinik araştırmalarının konusudur.
TALEN'lerTALEN'ler, TALE adı verilen bir DNA bağlanma alanını ve DNA'yı parçalama kabiliyetine sahip bir alanı birleştirerek üretilen yapay kısıtlama enzimleridir.
DNA bağlayıcı TALE alanı, amino asitler 12 ve 13 haricinde 33 veya 34 aynı amino asitin tekrarlarından oluşur. Bu son iki kalıntı, bir modüle çok basit bir koda göre bir DNA bazını tanıma yeteneği verir. Bu modülleri istenen sırada birleştirerek, genomun belirli bir dizisini tanıyan bir protein üretmek çok kolaydır. Bu TALE alanının bir DNA klevaj alanı ile füzyonu, istenen bir gen üzerinde çift sarmallı kırılmaları çok kolay bir şekilde indüklemeyi mümkün kılar.
Bu tür enzimlerin yapım hızları ve düşük maliyetleri, onları genom mühendisliğini gerçekleştirmek için mükemmel araçlar haline getirir.
Bu yeni yöntemler üzerinde yasal düzenleme yapmak için, çeşitli hükümetler, 8 Aralık 2008'de feshedilen genetik mühendisliği komisyonunu ve Haziran 2008'de oluşturulan Biyoteknoloji Yüksek Konseyi'ni oluşturdu.
İnsan Haklarının Korunması ve Biyotıp Sözleşmesinin 5. Bölümünün 18. Maddesine göre, in vitro embriyolar üzerinde araştırmalara kanunen izin verildiğinde, embriyonun yeterli şekilde korunmasını sağlar. Araştırma amacıyla insan embriyolarının oluşturulması yasaktır.
Araştırmacı He jiankui tarafından yapılan değişiklikler bu nedenle 1997 oviedo sözleşmesine göre yasa dışıdır.
Kasım 2018'de, CRISPR-Cas9 adı verilen genom düzenleme tekniği sayesinde, onları HIV'den koruyacağı varsayılan iki Çinli ikiz doğdu. Bu olay, uluslararası bir fikir birliğinin yokluğunu ve CRISPR tekniğinin insanlar üzerinde kullanımıyla ilgili Devlet uygulamalarındaki farklılıkların altını çizdi, araştırmanın denetimi esasen ulusal bir karaktere sahipti.
CRISPR-Cas9 veya daha basitçe CRISPR, bir canlı, bakteri, bitki veya hayvanın genomundan belirli bir diziyi eklemeyi, değiştirmeyi veya silmeyi mümkün kılan bir DNA mühendisliği tekniğidir. Uygulanması karmaşık olan önceki tekniklerin aksine, CRISPR-Cas9'un kullanımı kolaydır. Aynı zamanda daha hassas, daha güvenilir ve daha ucuzdur.
İnsanlarda, CRISPR tekniği hem embriyonik hücreleri hem de yetişkin bir bireyin hücrelerini değiştirmek için kullanılabilir. Müdahale, kök hücreler denen şeylere , diğerlerinin kaynaklarına odaklanabilir . İki popülasyon var. İlk olarak, gamet (spermatozoa ve ova) olarak da adlandırılan germinal, üreme kök hücreleri ve zigotta bulunan hücreler (gelişimin ilk aşamasında embriyo). Daha sonra somatik kök hücreler veya vücuttaki diğer hücreler. Bir somatik hücre üzerindeki bir genin modifikasyonu sadece tedaviye tabi olan insanı ilgilendirirken, gametlerin herhangi bir modifikasyonu yavruya iletilecektir.