Mutagenez , bir ya da daha fazla indükleme olan mutasyonlar , bir de genomun doğru ve gönüllü. Bu yöntem, DNA , RNA ve proteinlerin yapılarını değiştirmek için kullanılır . Bu moleküler biyoloji tekniği, 1978'de Michael Smith tarafından geliştirildi. Görünüşe göre, bölgeye yönelik mutajenez fikri, 1976'da İngiltere'deki Cambridge Enstitüsünde Clyde Hutchison ile yaptığı bir konuşma sırasında aklına geldi . DNA parçalarını saflaştırmak için oligonükleotidler. Bu büyük keşif ona 1993 yılında Polimeraz Zincir Reaksiyonunun mucidi Karry Mullis ile kimyada Nobel Ödülü kazandırdı .
Bölgeye yönelik mutajenez yöntemleri, polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanır. Mutasyonlar, önceden sentezlenen oligonükleotid primerleri kullanılarak eklenir. Bu primerler, mutasyona uğratılması gereken nükleotidler haricinde vahşi tip diziye tamamlayıcıdır. Aslında, PCR, nükleotid primeri ile hedef DNA dizisi arasında katı bir tamamlayıcılık gerektirmez. PCR reaksiyonunun sonunda, mutasyonlar ürünlere dahil edilir ve üç tipte olabilir:
1) İkameler: bir veya daha fazla nükleotit, aynı sayıda farklı nükleotit ile değiştirilir.
2) Eklemeler: hedef diziye bir veya daha fazla nükleotid eklenir.
3) Delesyonlar: Sekanstan bir veya daha fazla nükleotid çıkarılır.
Bölgeye yönelik mutageneze yönelik ilk yaklaşımlardan biri, örtüşme uzantısına dayanmaktadır. Tamamlayıcı primerler, PCR ile örtüşen uçlara sahip DNA fragmanları oluşturmak için kullanılır. Bu fragmanlar birleştirilir ve hibridizasyonu, üst üste binme bölgesinin uzamasına izin verir. Mutasyonlar, primerlerin dizisindeki nükleotidlerin değişmesiyle spesifik bir şekilde ortaya çıkar.
Pratikte, üç PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için iki çift primer kullanılır. Primerler 1 ve 2, mutasyonu kendi 5 'bölgesinde taşır ve birbirini tamamlar. Primerler 3 ve 4, amplifiye edilecek hedef DNA'yı sınırlandırır. İlk PCR, primerler 2 ve 3 ile gerçekleştirilir ve mutasyona uğramış bölge dahil olmak üzere hedef DNA'nın sol kısmının amplifiye edilmesini mümkün kılar. Primerler 1 ve 4 ile gerçekleştirilen ikinci PCR, mutasyona uğramış bölge dahil olmak üzere hedef DNA'nın sağ kısmını üretir. Saflaştırılmış, karıştırılmış ve denatüre edilmiş bu iki PCR'nin ürünleri, kendileri için ortak olan mutasyona uğramış bölge tarafından hibritlenebilir. Oligonükleotidler 3 ve 4 ile üçüncü bir PCR daha sonra mutasyon ile tam hedef DNA elde etmeyi mümkün kılar.
Diğer önemli yaklaşımlar arasında QuickChange vektörü üzerinde sahaya yönelik mutajenez yer alır.
PCR yoluyla birçok teknik mümkündür :