Bir DNA çipi , cam , silikon veya plastik olabilen küçük bir yüzey üzerine düzenli sıralar halinde bağlanmış DNA molekülleri topluluğudur . Bu son biyoteknoloji seviyesini analiz etmek mümkün kılan ifade ait genlerin ( transkriptleri a) hücre , bir numuneye, belirli bir anda ve ilgili olarak belli bir durumda bir doku, bir organ, bir organizma ya da kompleks bir karışımı, referans.
DNA çiplerine ayrıca gen çipleri , biyoçipler veya İngilizce terimlerle " DNA çipi, DNA-mikrodizi, biyoçip " denir . Fransızca DNA mikrodizisi ve DNA mikrodizisi de Office québécois de la langue française tarafından önerilen terimlerdir .
DNA çipinin prensibi, denatüre DNA'nın (tek sarmal), tamamlayıcı bir sarmalın ( hibridizasyon reaksiyonu ) varlığında çift sarmalını kendiliğinden yeniden oluşturma özelliğine dayanır . DNA'nın dört nükleik bazı ( A , G , C , T ) gerçekten de ikişer ikişer hidrojen bağlarıyla (A = T ve T = A; G ≡ C ve C ≡ G) eşleşme özelliğine sahiptir .
Bu söz prob (Biochip yüzeyine kovalent olarak sabit ekspresyon biz çalışma etmeye genlerin sentetik DNA temsilcisinin fragmanını) ve hedef (belirlemek ve / veya (örnek ölçmek için aradığı mRNA)). Hedefler floresan olarak etiketlenmiştir (aşağıya bakınız).
Mikrodiziler, proteinlere çevrilecek veya çevrilmeyecek RNA'ları ölçmek / tespit etmek için kullanılabilir. Bilim adamları , ifade analizinden veya ifade profilinden bahseder . Bir biyoçip üzerine bir milyona kadar prob eklemek mümkün olduğundan, DNA mikrodizileri muazzam bir yaklaşım oluşturur ve tek bir deneyde on binlerce ifade üzerinde bir tahminde bulunmaya izin verdikleri için genomik devrime katkıda bulunur. genlerin. Ancak DNA mikrodizi teknolojisini içeren çok sayıda farklı uygulama da vardır (mutasyonların taranması, yeniden dizileme, DNA/protein etkileşimleri, mikrobiyal ekoloji).
Pratikte, toplam RNA'lar incelenen hücrelerden ekstrakte edilir ve bazen deney için yeterli miktarda genetik materyalin elde edilmesini mümkün kılacak amplifikasyona tabi tutulur. Bu mRNA'lar daha sonra ters transkripsiyon tekniği ile tamamlayıcı DNA'lara (cDNA) dönüştürülür ve etiketlenir. Bu etiketleme artık bir floresan molekül ( florokrom ) tarafından sağlanmaktadır . Ağırlıklı olarak kullanılan iki florokrom vardır: Yeşil floresan olan Siyanin 3 (Cy3) ve kırmızı floresan ışıyan Siyanin 5 (Cy5). Bu şekilde etiketlenen hedefler (cDNA) daha sonra çip ile temas ettirilir (tüm probları yüzeyinde taşır), bu adım hibridizasyon olarak adlandırılır. Daha sonra her cDNA dizisi, kendisine tamamlayıcı olan problara hibritleşerek çift sarmallı bir prob/hedef dupleks oluşturacaktır. Biyoçip daha sonra , slayt üzerine sabitlenmiş probları tamamlayıcı olmadıkları için hibritleşmeyen cDNA ipliklerini çıkarmak için spesifik banyolarda yıkanır . Biyoçip daha sonra, Siyanin 3 veya Siyanin 5'in uyarma dalga boyunda çok yüksek çözünürlüklü bir tarayıcı tarafından analiz edilecektir. Taranan görüntü daha sonra, biyoçipe bağlı her bir sondada bir d değeri yoğunluğu ilişkilendirmek ve böylece belirlemek için bilgisayar tarafından analiz edilir Her sonda için hibridizasyon olup olmadığı.
İki koşul arasındaki gen ekspresyonunu karşılaştırmayı amaçlayan bir DNA biyoçip deneyi sırasında (örneğin: sağlıklı hücre ile hastalıklı hücre), iki hücre popülasyonunun toplam RNA'ları çıkarılır ve her biri farklı bir florokrom ile etiketlenir. İki numune daha sonra biyoçip üzerinde aynı anda biriktirilir, buna rekabetçi hibridizasyon denir. Belirli bir gen için, bu gene karşılık gelen cDNA moleküllerinin sayısı bir durumda diğerinden daha fazlaysa, bu cDNA'lar ve ilişkili problar arasındaki hibridizasyon tercih edilecektir. Böylece, kullanılan iki florokromun iki uzunluğundaki biyoçipi taradıktan sonra, yeşil sinyalin yoğunluğunu kırmızı sinyalle karşılaştırmak ve dolayısıyla çalışılan her gen için hangi koşul altında en çok ifade edildiğini bilmek mümkündür.
DNA mikrodizilerinin başlangıcı, 1991 yılında Stephen Fodor'un (Amerikalı bilim adamı ve Affymetrix şirketinin kurucusu ) yerinde sentez teknolojisi üzerine bir yayını ile başladı . Ardından birkaç olay devreye girer:
İki tür biyoçip analizi vardır:
Tek kanallı biyoçipin güçlü yönlerinden biri, anormal bir numunenin diğer numunelerin analizini etkilememesidir. Aksine, iki kanallı biyoçiplerde, diğer hedef numune mükemmel olsa bile, sonuçların kalitesini büyük ölçüde azaltmak için tek bir düşük kaliteli numune yeterlidir. Diğer bir güç, tek kanallı bir biyoçipten elde edilen verilerin, farklı deneylerden elde edilen diğer biyoçiplere kıyasla daha kolay olmasıdır. Ek olarak, tek kanallı biyoçip bazen belirli uygulamalar için tek olası çözümdür.
Aşağıdaki tablo İngilizce Wikipedia sayfasından alınmıştır .
| Sürecin veya teknolojinin adı | Açıklama |
|---|---|
| gen ifadesi | Bu, DNA çipinin en iyi bilinen kullanımıdır. Genlerin ifadesi, verilen farklı koşullar arasında veya zaman içinde karşılaştırılır. Hibridizasyon ve müteakip görüntü analizi yoluyla, bu süreç, belirli bir durumda hangi genlerin fazla veya az ifade edildiğini tanımlar. Bu genler tanımlandıktan sonra, aynı ekspresyon profiline sahip genleri birleştirmek için kümeleme analizleri gibi daha ileri in silico analizler gereklidir. Son olarak, sonuçlar genellikle kantitatif PCR veya Northern Blot gibi yöntemlerle gen tarafından gen tarafından doğrulanacaktır. (gen analiz yöntemleri) |
| kromatin immünopresipitasyon | Biyoçipler ayrıca kromatin immünopresipitasyon fenomenini de kullanabilir (Çipte Kromatin immünopresipitasyon veya ChIP-On-Chip ). Bu yöntem, genomdaki protein bağlanma bölgesinin yerini belirlemeyi mümkün kılar. |
| polimorfizm | DNA çipi ayrıca polimorfizmi tespit etmeyi, yani bir popülasyon içindeki veya popülasyonlar arasındaki alellerin nokta polimorfizmlerini tanımlamayı, bir popülasyon içindeki hastalıkların gelişimini tahmin etmeyi, mutasyonları değerlendirmeyi veya genler arasındaki bağlantıları analiz etmeyi mümkün kılabilir. |
| döşeme | Bu çipler, yeni transkriptlerin araştırılmasına adanmıştır ("kopyalanmış gen" teriminin anlamı anlaşılmaktadır). Yani kromozomun her bölümü (sadece bilinen genler değil) bir sonda tarafından hedeflenir. İlgi alanlarından biri, çok sayıda kodlayıcı olmayan RNA'ları (örneğin uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar gibi) keşfetmektir. Böylece transkriptleri başarılı bir şekilde haritalamak, ekzonları aramak ve hatta transkripsiyon faktörlerini aramak mümkündür . |
| kimerik gen biyoçipi | Kimerik bir gen (veya füzyon geni) içeren biyoçipler de vardır . Arkasındaki ilke, İngilizce'de alternatif birleştirme veya Fransızca'da alternatif birleştirmedir . Böyle bir biyoçip daha sonra füzyon ile kopyalanan genleri, dolayısıyla kanser örneklerinden tespit edebilir. |
| karşılaştırmalı genomik hibridizasyon | Bir karşılaştırmalı genomik hibridizasyon çip DNA kopya sayısı değişimleri analiz etmek için kullanılan bir DNA çip. Bu teknik esas olarak kanserleri ve genetik hastalıkları teşhis etmek için kullanılır. |
| gen kimliği | Bu DNA çipleri, gıdalardaki belirli organizma türlerini ( GDO'lar gibi ), hücre kültüründeki mikoplazmaları veya hastalıkları teşhis etmek için belirli bulaşıcı ajanları tespit etmek için kullanılır. Teknik esas olarak polimeraz zincir reaksiyonuna dayanmaktadır . |
Aşağıdaki listenin ayrıntılı olması amaçlanmamıştır, ancak biyoçiplerin uygulama alanlarına genel bir bakış sunar.
Çip, genellikle camdan yapılmış, yaklaşık olarak küçük boyutlu (6 cm x 3 cm ), üzerine hedeflenen bir nükleik asit parçasına (DNA veya RNA) tamamlayıcı probların eklendiği bir slayttır. Bir çipe bir milyona kadar prob eklenebilir, böylece birkaç on hatta yüz binlerce genin analizine izin verilir.
Çipe ne tür sondalar yerleştirilmelidir?
| oligonükleotidler | Uzun problar | |
|---|---|---|
| Kesmek | 15 - 70 deniz | > 100 deniz |
| Faydaları | - SNP tespiti (polimorfizm)
- "Tespit etmeye hazır" teslim edildi |
- Alellere / varyantlara karşı duyarsız
- Büyük miktarda üretim - Mevcut koleksiyonlar (EST, BAC ...) - Çift sarmal, daha fazla etiketleme seçeneği, daha iyi genom kapsamı |
| Dezavantajları | - Alellere / varyantlara
duyarlı - Seri üretim maliyeti - Oligoların tasarımı karmaşık bir adımdır |
- Daha düşük çözünürlük
- PCR ürünlerinin üretimi ağırdır - Çapraz hibridizasyon sorunu - Toplama hataları (EST) |
Ne tür genler söz konusudur?
Kendi içinde, test edilecek genlerin türü (bilinen veya bilinmeyen fonksiyonlara sahip genler) ile ilgili herhangi bir kontrendikasyon yoktur. Bununla birlikte, biyoçip deneylerinden güvenilir bilgiler elde edebilmek için, deneyin her adımının doğru ilerlemesini doğrulamak ve kontrol etmek için pozitif ve negatif kontrol problarının dahil edilmesi tavsiye edilir.
Bu yöntem, slayt üzerinde biriktirilmiş uzun probları (yaklaşık yüz nükleotid) kullanır. Problar, küçük damlacıklar veya noktalar halinde yüzeyde biriktirilmeden önce sentezlenir (bu nedenle İngilizce terimi mikroarray , "microtableau"). Lekelere batırılan robotik kol tarafından kontrol edilen ince iğneler kullanıyoruz . İğneler daha sonra fazla probları her noktaya enjekte edecektir. Nihai "ızgara" , hazırlanan probların nükleik asit profillerini temsil eder ve her bir prob, hedeflerle hibritleşmeye hazırdır.
Bu yöntem, bu çözümü akademik laboratuvarlar için daha erişilebilir kılan en basit yöntemdir . Dünyanın dört bir yanındaki bilim adamları ve araştırmacılar tarafından ihtiyaçları için doğru çipleri üretmek için kullanılıyor. Çipler her deney için kolayca özelleştirilebilir, çünkü araştırmacılar probların tipini ve yerini seçebilir, hatta probları kendileri sentezleyebilir.
Bilim adamları daha sonra, sondaları kendi ekipmanlarıyla analiz etmek için problarla hibridizasyon için kullanılan kendi hedef örneklerini oluşturabilirler. Bu, daha ucuz (ticari çip satın alma maliyetinden kaçınan) ve aynı zamanda gereksinimlerine uygun bir çip sağlar.
Ancak bu şekilde yapılan çipler , yerinde sentez ile yapılan çiplerle aynı prob yoğunluğuna sahip olamaz .
Bu çipler, kimyasal sentez yoluyla doğrudan destek (biyoçip) üzerinde küçük DNA problarının (<80-mer) sentezlenmesiyle yapılır.
Hedefler tarafından taşınan florokromların uyarılmasıyla prob / hedef etkileşimlerini ortaya çıkaran çok yüksek çözünürlüklü tarayıcılar (bir mikrometre düzeyinde) kullanılarak yüksek çözünürlüklü bir görüntü elde edilir. Fransa'da INNOPSYS şirketi, bu tür slaytların okunması ve analizine ayrılmış eksiksiz bir floresan tarayıcı yelpazesi geliştirir, üretir ve pazarlar: InnoScan 710 (2 renk, 3 µm / piksel, InnoScan 710-IR, InnoScan 910 ( 2 renk) , 1 µm / piksel) ve InnoScan 1100 (3 renk, 0,5 µm / piksel).
Yazılım, her bir genin ifadesinin dijital bir ölçümünü çıkarmak için görüntüdeki piksellerin yoğunluğunu yorumlar.
Bir DNA çipinin analizi ile büyük hacimli veriler üretilir ve deneyin sonuçlarını yorumlamak için birçok teknik kullanılır. Bu teknikler şunları içerir: