Floresan mikroskobu (veya epifloresans ) bir uygulandığı bir tekniktir optik mikroskop olgusunun yararlanarak floresans ve fosforesans yerine ya da geleneksel gözlem ek olarak yansıma doğal veya yapay görünür ışık ya da emilim.
Böylece çeşitli nesneleri, maddeleri (organik veya inorganik) veya ölü veya canlı organizma örneklerini gözlemleyebiliriz.
Artık klasik araştırma yöntemlerinin ve biyolojinin bir parçası ve moleküler görüntüleme ile gelişmeye devam ediyor .
Floresan yayan bazı organları tarafından sahip bir özelliktir ışık yüksek enerjili fotonlar emici sonra. Floresan mikroskobu, yayılan bu ışığın tespiti ile bir görüntünün oluşmasına dayanır. Stokes kayması (mikroskop ışık kaynağı tarafından yayılan) nesne uzunluğu tarafından emilir ve bir nesne tarafından yayılan dalga boyu arasındaki fark. İki dalga boyu arasındaki fark ne kadar büyükse, floresanı gözlemlemek o kadar kolay olur.
Floresansta iki tür nesne ayırt edilir:
Floresan mikroskopisinde, bu nedenle floresan maddeleri doğrudan görselleştirmek mümkündür. Floresan olmayan maddeler, hücreler, moleküller için, DNA'yı ve floresanları mavi renkte işaretleyen DAPI gibi florokrom adı verilen maddelerle işaretlemek gerekir .
Yeşil floresan protein (İngilizce Yeşil Floresan Protein veya GFP'de) gibi belirli genetik belirteçler de biyolojide genetiği değiştirilmiş organizmalarda endojen olarak üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır . Bu durumda florokrom , doğrudan hücrenin kendisi tarafından üretilen bir proteindir ve substrat eklenmesini gerektirmez. Floresans daha sonra doğrudan canlı hücrelerde görselleştirilebilir, bu moleküler görüntüleme ile geliştirilen alanlardan biridir .
Birçok markalama tekniği kullanılabilir:
Floresan maddeler, tek foton uyarımı ile uyarılabilir. Bunun için dalga boyu floroforu doğrudan uyaran bir uyarma ışığı kullanılır . Bu nedenle, yayılan floresan , uyarma ışınının geçtiği numunenin tüm kalınlığından gelebilir. Bu eş odaklı mikroskobun anahtar öğesi, daha sonra, odak dışı bölgelerden floresansı ortadan kaldıran detektörün önüne yerleştirilen bir "pencere" (bir iğne deliği veya bir eş odaklı iris) ile temsil edilir . Floresans sinyallerinin gözlemlenmesi beş unsura dayanmaktadır:
Bu uyarma, bir fotondaki optimum uyarımın bir katına yakın bir dalga boyundaki birkaç uyarma fotonunun hemen hemen eşzamanlı soğurulmasından oluşur. Bunun için kızılötesine yakın frekanslarda darbeli bir lazer kullanılır. Bu durumda, yalnızca lazer ışınının odak noktası bir uyarıcıdır (uyarma enerjisini birleştirmek için yeterli foton yoğunluğu). Genellikle uygulamalar iki foton mikroskobu ile sınırlıdır (floroforun iki foton tarafından uyarılması).
Bu sistem, üç ana nedenden dolayı önemli bir teknolojik gelişme olarak kabul edilir:
Pratikte, flüoresans emisyon verimliliği tek bir foton konfokalinden daha az iyidir ve sinyal / gürültü oranı daha düşüktür. Bu nedenle, kültürlenmiş hücrelerin veya doku kesitlerinin (50-70 um kalınlığında) gözlemlenmesi için çok az avantaj gösterir .
Bu teknik doğal olarak farklı emisyon spektrumlarına sahip birkaç floroforun eşzamanlı uyarılması için kullanılır.
Bu tekniğin bir varyantı, multifokal multifoton uyarımı ile floresan mikroskopisidir . Prensip aynıdır, ancak lazer ışını birkaç ışına bölünmüştür, bu da birkaç noktanın aynı anda taranmasını mümkün kılar. Bu, görüntülerin edinim süresinin azaltılmasını mümkün kılar.
Floresans teknikleri farklı mikroskop türleri ile kullanılabilir:
Bu cihazlar, üreticiye bağlı olarak dönen bir taret veya bir çekme kulağı üzerinde düzenlenmiş değiştirilebilir küp şeklinde parçalara sahiptir.
Bu “küpler”, hedefe giden ışığı, aranan floresanlara göre gözlemciye veya sensöre doğru süzer.
Bunlar, 2 filtre ve belirli dalga boylarını yansıtan ve diğerleri tarafından çaprazlanan "dikroik" bir ayna içerir.
Kaynağa doğru uyarma filtresi bulunur.
Gözlemci tarafında bariyer filtresi var.
Küpler ikaz ışıklarına göre listelenmiştir: ultraviyole, mor, mavi, yeşil ...
Bu teknik, özellikle bir flüoresan lipid probunun eklendiği lipit tek tabakalarını gözlemlemek için kullanılır . Ana lipidin bulunduğu faza bağlı olarak floresans gözlenir. Genel olarak prob, sıvı ile genişletilmiş (LE) fazda çözünür, ancak gaz (G) veya katı (S) fazlarında çözünmez. Bu, tek tabakanın oluşturduğu makro yapıları gözlemlemeyi mümkün kılar. Tersine, epifloresan mikroskobu ile dengede bir lipit tek tabakası gözlemlenir . Floresan lipid probu LE fazında çözünür, ancak G fazında değildir.Sonuç, dengede, duvarlarından oluşan kabarcık türlerini (ancak bir "kabarcık" üç boyutlu bir kavramdır) gözlemlememizdir. LE fazında lipid ve G fazında içi lipid Üç boyutlu bir örnek alırsak, sabun köpüğü alıp çok ince bir dilim kesmek gibi olur.
Bölünen bir insan kanser hücresinin üç bileşeninin epifloresans görüntülemesi. DNA bir mavi görünen protein denilen INCENP yeşil renkte görünür ve mikrotübül kırmızı. Her florofor , belirli bir uyarma dalga boyu ve filtrelerle ayrı ayrı görüntülendi, ardından CCD kamera ile çekilen fotoğraflardan bir görüntü yeniden oluşturuldu .
Bir sığır pulmoner arterinin endotel hücreleri (DAPI ile maviye boyanmış çekirdekler, FITC'ye bağlı bir antikorla yeşil etiketli mikrotübüller ve TRITC proteinine bağlanmış falloidin ile kırmızı etiketli aktin filamentleri ).
İnsan lenfosit çekirdeği, sentromere hibridize edilmiş problar tarafından kromozom 13 (yeşil) ve 21 (kırmızı) ile DAPI ile boyandı ( floresan içinde yerinde hibridizasyon ).
Maya hücre zarı , zar proteinlerinin iki floresan işaretleyici (RFP ve GFP) ile füzyonu ile elde edilen yapının (sarı renkte) gösterimi.
Nanometrik ölçekte bir insan kanser hücresinde YFP molekülünün tespiti.
Bir kemik kanseri hücresinin çekirdeği ( İngilizce konuşanlar için çift renkli lokalizasyon mikroskobu veya 2CLM olarak adlandırılan teknik ). Kısıtlı bir alanda (470 µm 2 ) bulunan 120.000 molekül için GFP ve RFP proteinleriyle kaynaşmış markörlerin floresansı ile elde edilen görüntü .