Meganucleases olan endodésoxyribonucléases ( nükleazlar ait DNA , bir tek kopya olarak mevcut olur, böylece (12 ila 40 baz çifti, DNA sekansları çift sarmal), büyük bir tanıma bölgesi ile karakterize edilir) verilen genom . Bir büyüklük sırasını almak için, I-SceI meganükleaz tarafından tanınan 18 baz çiftinden oluşan diziyi 1 kez karşılamayı ummak insan genomunun 20 katı büyüklüğünde olur. Bu nedenle meganükleazlar , en spesifik kısıtlama enzimleri olarak kabul edilir .
Meganükleazlar arasında, LAGLIDADG ailesinin homing endonükleazları, son on beş yılda, hedeflenen bir şekilde ve spesifik bir genetikte modifiye etmek için yakın zamanda geliştirilen stratejileri ve teknikleri kapsayan genomların incelenmesi ve mühendisliği için ayrıcalıklı araçlar haline geldi . canlı organizmaların bilgileri - veya genomu -.
Meganükleazlar, sekansları yüksek oranda hedeflenmiş yollarla değiştirmek, silmek veya modifiye etmek için kullanılabilen "DNA moleküler makaslarıdır". Protein mühendisliği yapılmış tanıma sitelerini değiştirerek, hedef sekans modifiye edilebilir. Meganükleazlar, her tür genomu - bakteriyel, bitki, hayvan - modifiye etmek ve özellikle insan sağlığı (viral genetik materyalin ortadan kaldırılması veya değiştirilmiş genlerin "onarımı" ) ve biyoteknolojik tarımda geniş yenilik olanakları açmak için kullanılır .
Meganükleazlar çok sayıda organizmada bulunur: arkeler (arkeler), bakteriler, fajlar , mantarlar, mayalar, algler, bazı bitkiler. Hücrenin farklı bölümlerinde ifade edilebilirler: çekirdek, mitokondri , kloroplastlar . Bu enzimlerin birkaç yüz tanesi tanımlanmıştır.
Meganükleazlar, esas olarak, homing endonükleazlar terimi altında gruplanan iki büyük enzim ailesi ile temsil edilir: intronik endonükleazlar ve inteinler. Doğada, bu proteinler hareketli genetik elementler, intronlar veya inteinler tarafından kodlanır . İntronlar, DNA'nın kesin bir yerine entegre edilerek ve ifade edilen meganükleaz sayesinde hareketli elementi içermeyen tamamlayıcı alelin kırılmasına neden olarak çoğaltılır . Grup I intronları ve inteinleri durumunda, kopma , çift sarmallı DNA'nın homolog rekombinasyon mekanizmasının müdahalesi sayesinde mobil elemanın kesik bölge seviyesinde kopyalanmasına neden olur .
Meganükleazların kesin işlevi iyi bilinmemektedir. En yaygın hipotez, onları kodlayan genetik materyalin, çift sarmallı DNA'nın hücresel onarım mekanizmalarını kullanarak, konakçılarının genetik materyalini değiştirmeden çoğalmak ve iletmek için parazitik bir unsur olarak işlev görmesidir.
Beş evreli endonükleaz ailesi veya sınıfı vardır.
En çok temsil edilen ve en iyi bilinen, LAGLIDADG adlı ailedir. Çoğunlukla ökaryotik tek hücreli organizmaların mitokondri ve kloroplastlarında bulunur. Adı, bu ailenin tüm proteinlerinde az çok korunmuş bir şekilde bulunabilen bir amino asit zincirine karşılık gelir. Bu küçük proteinler ayrıca birbirine çok yakın kompakt üç boyutlu yapılara sahip olma özelliğine sahiptir.
En iyi karakterize edilmiş endonükleazlar ve araştırma ve genom mühendisliğinde en çok kullanılanlar arasında, I-SceI ( fırıncı mayası Saccharomyces cerevisiae'nin mitokondrilerinde keşfedilmiştir ), I-CreI (yeşil yosun kloroplastlarından Chlamydomonas reinhardtii ) ve I-DmoI sayabiliriz. (archaeobacterium Desulfurococcus mobilis'den ).
En iyi bilinen LAGLIDADG endonükleazları, homodimerlerdir (örneğin, aynı protein alanının iki kopyasının birleşmesinden oluşan I-CreI) veya başka iç simetri sergileyen monomerlerdir (I-SceI). Katalitik alanı içeren DNA bağlanma bölgesi, kesme noktasının her iki tarafında dağıtılmış iki bölümden oluşur. Bağlanma yarı bölgeleri son derece benzer olabilir ve yarı palindromik bir DNA sekansına (I-Crel) bağlanabilir veya farklı olabilir (I-SceI).
Onlara yüksek hassasiyet ve diğer kısıtlama enzimlerinden çok daha düşük hücresel toksisite sağlayan yüksek özgüllükleri nedeniyle, meganükleazlar özellikle umut verici genom modifikasyon araçları olarak 1990'ların başlarında tanımlanmışlardır.
Bununla birlikte, meganükleazlar tarafından indüklenen genetik rekombinasyonların gerçekleştirilmesi , mevcut repertuar ile sınırlıydı. Gerçekte, doğada yüzlerce meganükleaz bulunsa ve her biri kendi tanıma sahasının küçük varyasyonlarını tolere etse bile, belirli bir geni istenen lokasyonda kesebilen bir meganükleaz bulma olasılığı son derece zayıftır. Arzu edilen tanıma sahası ile sağlanan yeni meganükleazların mühendisliği, bu nedenle hızla birkaç araştırma laboratuvarının hedefi haline geldi. En kapsamlı araştırma ve uygulamalar, LAGLIDADG ailesinin homing endonükleazları ile ilgilidir.
"Kişiye özel" meganükleazlar oluşturmak için iki ana yaklaşım türü uygulandı:
Bu iki yaklaşım, yüksek verimlilik ve özgüllüğü korurken yeni enzimler yaratma olasılıklarını artırmak için birleştirilebilir. Bir Fransız biyoteknoloji şirketi olan Cellectis'teki bilim adamları, böylece homodimerik meganükleaz I-CreI ve diğer meganükleaz yapılarından türetilen 20.000'den fazla protein alanından oluşan bir koleksiyon geliştirdiler. Araştırma laboratuvarları veya endüstriyel oyuncular için ölçüm yapmak üzere yapılmış fonksiyonel kimerik heterodimerler halinde birleştirilebilirler. Böylece onbinlerce protein biriminden oluşan büyük bir banka oluşturuldu. Hedef bölgeyi tanıyan kimerik meganükleazlar elde etmek ve böylece çok çeşitli ihtiyaçları karşılayabilecek araştırma ve geliştirme araçlarına (temel araştırma, sağlık, tarım, endüstri, enerji vb.) Sahip olmak için birleştirilebilirler.
Bu teknik, özellikle endüstriyel ölçekte, mutasyonu dahil olan insan XPC geni ayırabilen iki meganucleases vb virüsler, bitkiler, genetik dizileri için ve üretimi için çok sayıda meganucleases spesifik geliştirmek mümkün kılmıştır Xeroderma pigmentosum , bir hastalık Cilt kanserine yatkınlık yaratan ciddi monojenik cilt UV ışınlarına maruz kaldığında yanar.
Diğer bir yaklaşım, bilgisayar modellerine, değiştirilmiş meganükleazların aktivitesine ve tanınan nükleik asit dizisinin özgüllüğüne dayalı olarak olabildiğince doğru bir şekilde tahmin etmeye çalışmaktır. Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilen bir ABD konsorsiyumu olan " Kuzeybatı Genom Mühendisliği Konsorsiyumu " , hematopoietik kök hücrelere müdahale ederek lösemiyi tedavi etmek amacıyla bu yola girmiştir . Model tahmini, sahaya yönelik mutagenez ve in vitro biyokimyasal analiz yapılarak doğrulanır ve yönlendirilir .
Cellectis tarafından üretilen meganükleazlar hakkında açıklayıcı video