spektrofotometre

Bir spektrofotometre bir gerçekleştirmek için bir enstrümandır spektrofotometrik ölçümü . Bir spektrometresi veya spektroskop , mümkün bir gerçekleştirmek mümkün kılan bir cihazdır spektrometrik ölçüm ait absorbans a çözeltisi bir de verilen dalga boyu ya da belirli bir bölge üzerinde spektrumu .

Prensip

Göre Beer-Lambert yasasına , bir çözeltinin absorbansı, maddenin ışık ışınlarını emdiği dalga boyunda olması kaydıyla, çözeltinin madde konsantrasyonu ile orantılıdır. Bu nedenle dalga boyu, konsantrasyonunu bilmek istediğimiz maddeye göre ayarlanır.

• Beer-Lambert yasasına göre absorbans , solüsyonun konsantrasyonunun C, molar absorpsiyon katsayısının ve L'den geçen solüsyon uzunluğunun bir fonksiyonudur.ATλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

ATλ=-günlük10⁡benben0=ελ⋅ℓ⋅VS{\ displaystyle A _ {\ lambda} = - \ log _ {10} {\ frac {I} {I_ {0}}} = \ varepsilon _ {\ lambda} \ cdot \ ell \ cdot C}çözümün geçirgenliği nerede .benben0{\ displaystyle {\ frac {I} {I_ {0}}}}

• Not, ve çalışma dalga boyunun bir fonksiyonu olarak, bu emme spektrumları bir fonksiyonu olarak seçilir.ATλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

Burada iki spektrum üst üste bindirilmiştir, bunları bağımsız olarak elde etmek için , farklı dalga boylarında (diğer her şey eşit olmak üzere) bir NAD + çözeltisinin (sırasıyla NADH, H + ) absorbansını ölçtük .

Buradaki maksimum absorbans dalga boyu , iki molekül için max = 260  nm'dir . Bu nedenle bu dalga boyunda çalışmak tercih edilecektir. Öte yandan, örneğin, NAD +' nın NADH, H +' ya indirgendiği bir enzimatik reaksiyon sırasında NADH, H +' yı tahlil etmek istersek , = 340  nm'de çalışmak daha mantıklıdır çünkü burada sadece NADH, H + ölçüyoruz. çünkü karışımda mevcut olsa bile NAD + absorbansı sıfırdır. λ{\ görüntü stili \ lambda}λ{\ görüntü stili \ lambda}

Kızılötesi (IR) spektrometreler esas olarak tanımlama için kullanılır. Pratikte UV-görünür spektrometrelerin kantitatif analizler için kullanıldığı, IR spektrometrelerin ise kalitatif enstrümanlar olduğu söylenebilir. Her ikisi de benzer optik prensipleri kullanır, ancak IR spektrometre frekansı numuneyi tarar.

Galeri:

• Laboratuvar spektrometresi (kapak açık).

• Laboratuvar spektrometresi (kapalı).

• Başka bir model.

• Bir yüzeyin rengini (genellikle L*a*b* sisteminde ifade edilir) ölçmek için elde taşınabilir spektrometre .

UV-görünür spektrometre (UV: ultraviyole) şunları içerir:

• bir ışık kaynağı veya kaynakları  : görünür spektrumda ölçüm için beyaz ışık ( polikromatik ışık ) ve/veya UV ışığı.
  • UV lambası genellikle döteryum tipindedir (aralık 195 ila 380  nm , örneğin 1000  saatlik lamba ömrü ).
  • Görünür lamba genellikle halojen tipindedir ( örneğin , 320 ila 1000  nm aralığında , 500  saatlik kullanım ömrü ).
  • Ayrıca ksenon lamba spektrometreleri de vardır; (190 ila 1.100  nm aralığında )
• kaynaktan gelen ışığı kıran bir ağ tarafından oluşturulan bir monokromatör . Analiz edilecek çözeltiden geçecek ışığın dalga boyunu seçmenize olanak tanır;
• bant genişliğini ayarlamak için sabit veya değişken genişlikte bir yuva;
• analiz edilecek çözeltinin istenen sıcaklıkta tutulmasına izin veren bir küvet tutucu, bu sıcaklık bir su devresi veya bir Peltier etkisi ile korunur . Sabit bir sıcaklıkta bu bakım, enzimatik kinetik ölçümlerinde çok faydalıdır , aslında reaksiyon hızı sıcaklığa bağlıdır;
• Bir saydam küvet incelenebilir çözüm yerleştirildiği. Numunenin kalitesine ve miktarına bağlı olarak, genellikle plastik (görünür spektrum, UV'ye yakın) veya kuvars (UV, ancak çok pahalı küvetler) olmak üzere farklı küvetler vardır.

Kullanılan solvent ve reaktif(ler) her zaman şeffaf değildir, sadece solvent ve reaktifi yerleştirerek bir "boş" veya kompanzasyon göstergesi, yani cihazın (dara) sıfırlanması zorunludur ( s) çalışılan her dalga boyu için numuneyi içeren küvetin ölçümünden önce küvette kullanılır.
Araştırma modelleri genellikle çift ışınlıdır ve çözücü ve reaktif(ler)i içeren referans küvet ve numuneyi içeren küvet (çözücü ve reaktif(ler) ile) olmak üzere iki küvet kullanır. Referans küvetteki sıvı daha sonra otomatik olarak çıkarılır (otomatik sıfırlama işlevi);

• bir fotoelektrik hücre , alınan fotonların sayısıyla orantılı bir akımı geri yükler . Son modellerde, tek fotodiyot tipi dedektör bazen bir CCD dizisi veya bir diyot dizisi ile değiştirilir (her hassas hücre sabit bir renk alır). En hassas modeller bir fotoçoğaltıcı veya PMT tipi dedektör kullanır;
• tepkisi bu elektrik akımıyla orantılı olan ve ışık yoğunluğunun nispi bir ölçümüne izin veren bir elektronik detektör.

Spektrometrisi tespit etmek için kullanılır konsantrasyonu bir boya çözeltisi (adı verilen bir işlem kolorimetrik deneyi ).

Uygulama alanları

biyolojide

• MTT testi yapılırken spektrometre kullanılır .
• Olarak moleküler biyoloji , sırasında kullanılan DNA ekstraksiyonu DNA miktarını ve saflığı belirlemek için,. Nükleik asitlerin maksimum absorbans alanı olan 260  nm dalga boyu kullanılır. 280  nm'de ikinci bir ölçüm , ekstraksiyonun saflığını, yani DNA solüsyonunda kalıntı proteinlerin varlığını kontrol etmeyi mümkün kılar.

Saflaştırılmış bir DNA çözeltisi için, R oranı 1.8 ile 2 arasında olmalıdır. Eğer R, 1.8'den önemli ölçüde düşükse, bu durumda proteinler muhtemelen çözeltiyi kirletiyor demektir. 2'den büyük, bu oran RNA tarafından olası bir kontaminasyonu gösterir.

R = (A 260 - A 320 ) / (A 280 - A 320 ) (sık durum) A 320 = 0 olduğunda R basitleştirilir .

DNA konsantrasyonu, bir korelasyon faktörü kullanılarak 260  nm'deki ölçümden hesaplanabilir :

• Çift sarmallı DNA: 1 Abs = 50 ng / µl
• Tek iplikli DNA: 33 ng / µl (tek iplikli RNA gibi)
• RNA: 1 Abs = 40 ng / ul.

Olarak biyokimya , bu (dalga boyu onları ölçmek için, proteinlerin saflaştırılması sırasında kullanılan 280  nm ) ve saflık düzeylerini (dalga boyu belirlemek için 260  nm ).

Eczanede

Farklı kan enzimlerinin kinetik analizi, alkalin fosfataz tayini: kolestaz, laktat dehidrojenaz: miyokard enfarktüsü, hemoliz.

fizikte

Işığın analizi, ışık emisyonunun kaynağındaki kimyasal bileşenleri belirlemeyi mümkün kılar: örneğin, yıldızların kimyasal bileşimi.

Kimyada

Belirli bir dalga boyundaki çözeltiler absorpsiyon analizi sağlar doz uygun olarak bu çözeltilerin Beer-Lambert kuralına (konsantrasyon ışık emme logaritması ile orantılı). Bu nedenle, absorbe edilen ışık miktarı ile çözeltideki kimyasal bileşik konsantrasyonu arasında doğrudan bir ilişki vardır. Zamanla absorpsiyonun izlenmesi, kimyasal reaksiyonların (kinetik) hızını karakterize etme yöntemidir.

Bir frekans taraması, ele alınan enerji geçişinin doğasına geri dönerek çözeltide bulunan türleri karakterize etmeyi mümkün kılar.

Grafik endüstrilerinde

Plotter gibi çıktı cihazlarını kalibre etmek için renkleri ölçmek için kullanılır .

bibliyografya

• Georges Bruhat , Optique , altıncı baskı, referans kursları koleksiyonu, Dunod, 2005, 1152 s.

Şuna da bakın:

• spektrofotometri
• spektrometri

Notlar ve referanslar

1. Bkz. G. Bruhat (2005), Optik , altıncı baskı, Dunod: § Spektrofotometri.
2. Genellikle molar absorpsiyon katsayısı için kullanılan birim ile homojenlik ile uzunluk cm olarak ifade edilir. Bu nedenle çoğu küvet L = 1  cm'de standardize edilmiştir .