transfeksiyon

Gen transferi işlemi, yani vektör olarak bir virüs kullanmayan ökaryotik hücrelere ekzojen genetik materyalin sokulması işlemine, transdüksiyonun aksine transfeksiyon denir . "Transfeksiyon" teriminin bakteriyel transformasyon sürecine oldukça benzer olduğuna dikkat edin , ancak bu terim, değiştirilmiş bir fenotip ve anarşik büyüme (düz İngilizce olarak, kanser öncesi bir aşama) ile ilişkisi nedeniyle hayvan hücrelerine uygulanmadı.

Tipik olarak, bir plazmit süper sarmal DNA, küçük bir enterferans yapan RNA veya diğerleri gibi hücre dışı moleküllerin girişine izin vermek için hücrelerdeki gözeneklerin geçici olarak açılmasıyla gerçekleştirilir .

Yabancı DNA'yı (gözenekli hücreler) kabul etmek üzere manipüle edilen hücrelere "yetkili hücreler" ( yetkin hücreler ) denir .

yöntemler

Bir hücreye eksojen DNA sokmanın farklı yöntemleri vardır .

• Daha geleneksel ve daha ucuz, ancak aynı zamanda daha az güvenilir olanlardan biri, 1977'de S. Bacchetti ve Graham FL tarafından keşfedilen kalsiyum fosfat ile transfeksiyondur . Tamponlu salin HEPES (HEPES-tamponlu salin solüsyonu - HeBS) iki kat konsantre ve fosfat iyonları içerir. transfekte edilecek DNA'yı içeren bir kalsiyum klorür çözeltisi ile birleştirilir . Bu iki çözelti birleştirildiğinde, yüzeyinde transfekte edilecek DNA'yı bağlayan ince bir kalsiyum fosfat çökeltisi oluşur. Çökeltiyi içeren süspansiyon daha sonra transfekte edilecek hücrelere eklenir (genellikle tek katmanlı bir hücre kültürü ). Tam olarak anlaşılmayan bir süreçle hücreler, çökelti içeren DNA'yı bünyesine katar (Ca2 + iyonları , hücreye girmesine izin veren DNA'nın negatif polaritesini maskeler).
  Kalsiyum fosfat transfeksiyonu, geçici transfeksiyonlar sağlamak için özellikle 293 hücre ile kullanılır .
• Çok etkili bir yöntem, transfekte edilecek DNA'nın lipozomlara , yani hücre zarlarınınkine benzer yapısal özelliklere sahip misellere dahil edilmesi ve bunların etkin bir şekilde kaynaşmasına izin vererek DNA'yı hücrede serbest bırakmaktır. Ökaryotik hücreler için, hücrelerin daha fazla duyarlılığı nedeniyle lipidlere ve polikatyonlara dayalı transfeksiyon kullanılır.
• Diğer yöntemler , DNA'yı bağlamak ve hücreye taşımak için polietilenimin (PEI) gibi dendrimerler olarak adlandırılan yüksek düzeyde dallanmış polikatyonik ajanlar kullanır .
  Polikatyon, DNA'daki negatif fosfatlara bağlanır ve onu tamamen kapsar. Oluşan kompleks genel olarak pozitiftir ve plazma zarının negatif olan polisakkaritlerine bağlanabilecektir. Kaynaktan Tris genellikle transfeksiyon çözeltisine dahil, zar geçirgenliğini artırır.
  Membrana bağlandıktan sonra, kompleks endositoza tabi tutulur ve endozoma gönderilir . Buna ek olarak, polietilenimin protonları yakalayan bir proton süngeri eşsiz özelliklere sahiptir lizozom bu endozom ile birleşir olarak bu şekilde etkisiz hale, asit hidrolazlar DNA düşürebilir.
  DEAE-Dextran durumunda, lizozomal protonların alımı, bir lizozomotropik ajan ( klorokin ) tarafından sağlanır .
  Bir hala tam olarak anlaşılamamıştır işlemle, DNA polikatyon kompleks yapraklar endozom ve ifade edilir çekirdeğin, (geçici transfeksiyon, içerisine doğru bakınız aşağıda (stabil transfeksiyon) ya da genom içine entegre etmek ve ardından ifade bakınız aşağıda ) . . .
• Yine diğerleri elektroporasyon , ısı şoku ve GeneCellin gibi reaktiflerin özel özelliklerini kullanır .
• Transfeksiyona doğrudan bir yaklaşım , DNA'nın eylemsiz bir katının (genellikle altın) bir nanoparçacığına bağlandığı ve daha sonra doğrudan hücre çekirdeğine "vurulan" ( vurulan ) gen tabancası sistemidir .
• Magnetofection içeren parçacıklar konsantre etmek için manyetik alanları kullanır bir transfeksiyon yöntemi , nükleik asit gövdesinin hedef hücrelere in utero ve örnek. Bu yöntem, biyokimyasal ( katyonik lipidler veya polimer atomları) ve fiziksel ( elektroporasyon , biyolistik ) transfeksiyon yöntemlerinin avantajlarını, dezavantajları (düşük verim, toksisite) hariç tutarak tek bir sistemde birleştirmeye çalışır.

Kararlı ve geçici transfeksiyon

Çoğu transfeksiyon uygulamasında, transfekte edilen genin sadece geçici olması yeterlidir. Yerleştirilen DNA genellikle hücre genomuna dahil edilmediğinden, normalde hücre mitozu sırasında en geç kaybolmaz . Bu genin hem ana hücrelerin hem de yavru hücrelerin genomunda kalması isteniyorsa, stabil transfeksiyon gerçekleştirilmelidir.

Bunu yapmak için başka bir gen birlikte transfekte edilir. Bu gen, hücreye belirli bir toksine karşı direnç gibi seçici bir avantaj sağlar . Verim çok düşük olmasına rağmen, bazı hücreler eksojen DNA'nın yerini değiştirmiş ve onu genomlarına entegre etmiş olacaktır; hücre kültürü ortamına toksin (hücrenin dirençli hale geldiği) eklenirse, sadece transfekte edilen hücreler çoğalabilecek , diğerleri ölecektir. Kültürde birkaç pasaj için bu seçim basıncını uyguladıktan sonra, sadece stabil olarak transfekte edilmiş hücreler direnir ve kültürlenmeye devam edebilir.

Kararlı transfeksiyon elde etmek için yaygın olarak kullanılan bir ajan , neomisin direnç geninin ürünü tarafından nötralize edilebilen bir toksin olan G418'dir ( geneticin ) .

bibliyografya

• Bacchetti ve Graham, PNAS , cilt. 74, s. 1590-94, NCBI [1] aracılığıyla edinilebilir .

Notlar ve referanslar

1. Plank C, Zelphati O, Mykhaylyk O, “  Manyetik olarak geliştirilmiş nükleik asit iletimi. On yıllık manyetofeksiyon-ilerleme ve beklentiler  ”, Adv. İlaç Teslimatı Rev. , cilt  63, no .  14–15,2011, s.  1300–31 ( PMID  21893135 , PMCID  7103316 , DOI  10.1016 / j.addr.2011.08.002 )

Dış bağlantı

• Hücre transfeksiyon protokolü