DNA sekanslama ve sekans sırasını belirlemek için olan bir nükleotid bir fragmanına DNA verilmiştir.
DNA sekansı canlıların hayatta kalmak ve üremek için gereken bilgileri içerir. Bu nedenle, bu dizinin belirlenmesi, hem organizmaların nasıl yaşadığını bilmeyi amaçlayan araştırmalar için hem de uygulamalı denekler için yararlıdır. In tıp , tespit teşhis ve potansiyel olarak tedavi bulmak için kullanılabilecek genetik hastalıklar ve viroloji . Olarak biyoloji , DNA dizilerinin çalışma için önemli bir araç haline gelmiştir türlerinin sınıflandırılmasında .
DNA dizi. 1970'lerin ikinci yarısında icat edilmiştir iki yöntem, bağımsız birer geliştirilmiştir Walter Gilbert takımı içinde ABD ve bu diğer Frederick Sanger içinde, (1977) Birleşik Krallık . Bu iki yöntem taban tabana zıt ilkelere dayanmaktadır: Sanger yaklaşımı seçici enzimatik sentez yöntemidir , Maxam ve Gilbert'inki ise seçici kimyasal bozunma yöntemidir . Bu keşif için, Gilbert ve Sanger, 1980 yılında kimyada Nobel Ödülü'ne layık görüldü .
Başlangıçta, Sanger'in yöntemi , tamamlayıcı ipliğin enzimatik sentezi için bir şablon görevi gören tek iplikli DNA'nın mevcudiyetini gerektiriyordu . Bu nedenle, genomu 1977'de dizilen ilk biyolojik organizma bakteriyofaj virüsü φX174'tür . Bu virüs, viral partikül içinde kapsüllenmiş tek iplikli DNA'dan oluşan bir genoma sahip olma özelliğine sahiptir.
Son 25 yılda Sanger yöntemi, birkaç önemli teknolojik gelişme sayesinde geniş çapta geliştirilmiştir:
Maxam ve Gilbert'in yöntemi toksik kimyasal reaktifler gerektirir ve analiz edebildiği DNA parçalarının boyutu (<250 nükleotid) açısından sınırlı kalır. Robotize edilmesi daha az kolay, kullanımı artık gizli hale geldi.
Bu yöntem geleneksel olarak küçük nokta sıralamasını gerçekleştirmek için kullanılır. Tüm bir genomu dizilemek için bunun yerine yeni nesil dizileme kullanılır. Bu yöntemin ilkesi, dizilenecek DNA parçasının bir kısmına tamamlayıcı olan küçük bir oligonükleotid (primer) kullanılarak DNA'nın polimerizasyonunun başlatılmasından oluşur. Primerin uzatılması, Klenow fragmanı ( 5'→ 3' eksonükleaz aktivitesinden yoksun bir DNA polimeraz I) tarafından gerçekleştirilir ve PCR için kullanılan termostabil DNA polimerazlar tarafından korunur . Dört deoksiribonükleotit (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ve ayrıca dört dideoksiribonükleotitten birinin (ddATP, ddCTP, ddGTP veya ddTTP) düşük konsantrasyonu eklenir.
Bu dideoksiribonükleotitler, zincir sonlandırıcı "zehirler" olarak işlev görür: yeni sentezlenmiş zincire dahil edildikten sonra, bir 3'-OH ucuna sahip olmadıkları için (hidroksil yerine sadece bir hidrojen) daha fazla uzamayı önlerler. Bu sonlandırma, spesifik olarak, reaksiyona dahil edilen dideoksiribonükleotide karşılık gelen nükleotit seviyesinde gerçekleşir. Aynı DNA parçasının tam dizilimi için, bu reaksiyon dört farklı dideoksiribonükleotid ile paralel olarak dört kez tekrarlanır.
Örneğin ddGTP'nin eklendiği reaksiyonda sentez G seviyesinde durur. Hem dGTP hem de az miktarda ddGTP içeren reaksiyon karışımı, DNA polimerazın bu nükleotidlerden herhangi birini kullanıp kullanmadığına bağlı olarak sonlandırma istatistiksel olarak gerçekleşir. Bu, tümü dizideki G'lerden birinde sona eren, artan boyutlarda DNA parçalarının bir karışımı ile sonuçlanır. Bu parçalar daha sonra bir poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile ayrılır , bu da dizideki Gs'nin konumunu belirlemeyi mümkün kılar.
Bu şekilde sentezlenen parçaların tespiti, sentezlenen DNA'ya bir izleyici dahil edilerek yapılır. Başlangıçta bu izleyici radyoaktifti; günümüzde, ya oligonükleotide ya da dideoksiribonükleotide bağlı floresan izleyiciler kullanılmaktadır.
Bu yöntem, DNA'nın kimyasal bozunmasına dayanır ve seçici bölünmeler elde etmek için dört baz A, T, G ve C'nin farklı reaktivitelerini kullanır. Kesiklerin sırasını yeniden oluşturarak, karşılık gelen DNA'nın nükleotid dizisine geri dönebiliriz . Bu kimyasal sıralama ardışık altı adıma ayrılabilir:
Bir genomun yapısının bütün olarak bilgisi, dizilemesinden geçebilir. Bununla birlikte, genomların boyutu birkaç milyon baz (veya megabaz) olduğundan, bu kadar çok sayıda veriyi işleyebilmek için moleküler biyoloji yaklaşımlarını bilgisayar bilimininkiyle birleştirmek gerekir.
Tüm genom dizilemesinin iki ana prensibi kullanılır. Her iki durumda da genomik DNA , enzimatik ( kısıtlama enzimleri ) veya fiziksel ( ultrason ) yöntemlerle önceden parçalanır :
Bu iki ilke arasındaki temel fark, hiyerarşik dizilemenin bir dizi büyük klonu (~ 100 kb) hizalamaya çalışması, genel yöntemde ise tüm genomun dizilenen ve sonra hizalanan küçük parçalara indirgenmesidir.
Ekstraksiyondan sonra, genomik DNA sonikasyon yoluyla 50 ila 200 kb'lik parçalara kesilir ve daha sonra bakteriyel yapay kromozomlar veya BAC gibi uygun bir vektörde klonlanır . Klonların sayısı, çalışılan genomun toplam uzunluğunun 5 ila 10 katı bir kapsamaya izin vermelidir. Klonların örtüşmesi ve sıralanması ya spesifik probların hibridizasyonu ile veya kısıtlama profillerinin analizi ile veya daha sık olarak BAC'lerin uçlarının sekanslanması ve hibridizasyonundan sonra bir sıralama ile gerçekleştirilir. Klonları sipariş ettikten sonra, bunlar ayrı ayrı parçalanır ve dizilir, ardından biyoinformatik hizalama ile birleştirilir.
Bu yöntemin avantajları, BAC'lerin örtüşmesi sayesinde parçaların daha kolay birleştirilmesi, parçaları mevcut veritabanlarıyla karşılaştırma olasılığı ve sıralama çalışmasının her biri sorumlu bir laboratuvara sahip birkaç laboratuvar arasında paylaşılması olasılığıdır. kromozomal bölge.
En büyük dezavantajı, nihai biyoinformatik analizini zorlaştıran, memelilerinki gibi belirli genomlarda çok sık olan tekrarlanan dizileri içeren fragmanların klonlanmasının zorluğudur.
İlk olarak 1970'lerin sonlarında Cambridge'deki Frederick Sanger laboratuvarında virüslerin ilk genomlarını sıralamak için tasarlanmış bir genomik DNA dizileme yöntemidir .
Bu yöntem, özellikle Celera Genomics şirketi içinde büyük genomların dizilenmesi için Craig Venter tarafından popüler hale getirildi . İlk uygulama, bakteri genomlarının, ardından Drosophila genomunun ve son olarak insan ve murin genomunun dizilenmesiydi . Bu tekniği kullanarak tam genom dizilimi gerçekleştirmek için, rastgele genomik DNA parçalarından oluşan iki ila üç kitaplık yapılır. Kütüphaneler arasında, fragmanlar hem büyüklük hem de genom üzerinde konum bakımından farklılık gösterir . Bu kitaplıklardan birçok klon dizilir ve daha sonra birleştirilir. Toplam dizi, tüm kitaplıkların biyoinformatik araçları kullanılarak işlenmesiyle, üst üste binen diziler kullanılarak fragmanların hizalanmasıyla elde edilir.
Hiyerarşik sıralama ile sıralamaya göre avantajları, tekniğin hızı ve düşük maliyetidir. Dezavantajı, bilgisayar işlemenin, memelilerin genomlarında sıklıkla bulunan büyük tekrarlanan dizileri içeren fragmanları hizalamayı mümkün kılmamasıdır.
Bu yöntem genellikle av tüfeği (testereli av tüfeği) veya Tüm Genom Av Tüfeği (WGS) olarak adlandırılır. Bu metafor, genomik DNA'nın başlangıçtaki parçalanmasının rastgele doğasını gösterir: tüm genom püskürtülür, biraz bu tür ateşli silahların peletlerinin dağılması gibi.
Hibridizasyon yoluyla dizileme, birkaç yüz (birinci nesil çipler için) ila birkaç bin oligonükleotid içeren DNA çiplerinin kullanımına dayanır . Analiz edilecek DNA, daha sonra tamamlayıcı oldukları oligonükleotitlerle hibritleşecekleri çip üzerinde inkübe edilen çok sayıda parçaya bölünür. Yongası (hibritlenmiş oligonükleotit tespiti) okunması mümkün spektrumunu elde edilmesini mümkün kılar DNA dizisinin alt dizileri kendi bileşimini demek ki, n, nükleotid, burada n, kullanılan yonga üzerindeki problar boyutudur. Spektrumun bilgisayarla işlenmesi daha sonra tüm dizinin yeniden oluşturulmasını mümkün kılar.
Sanger'in radyoaktivite yerine floresan kullanan tekniğinin bir uyarlaması . Dahil edilen dideoksinükleotitler, özellikle floresan moleküller veya “ florokromik ” floroforlar (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA ve ddTTP-ROX) ile etiketlenir.
Dizi reaksiyonu, PCR ile gerçekleştirilir . Taq polimeraz gerçekleştirir floresan ile etiketlenmiş bir dideoksinükleotidine dahil edilmesine uzamaya. Sentezlenen parçalar daha sonra elektroforez ile ayrılır .
Otomatik bir cihaz dizi reaksiyonunu alır ve bunu bir poliakrilamid polimer içeren bir kapiler içine enjekte eder . Göç sırasında, bir lazer optik sistem, lazer penceresinin önünden geçen ve parçayı uyarma altında sonlandıran ddNTP tarafından yayılan floresansı algılar (JOE “ddATP” için yeşil ışık, 5-FAM “ddCTP” için mavi, için sarı ışık). TAMRA "ddGTP" ve ROX "ddTTP" için kırmızı.
Bu molekülleri boyutlarına göre elektroforez ile ayırarak , floresansı bu sonlandırıcı ddNTP'nin tabanına karşılık gelen bir elektroferogram (veya florogram ) üzerinde eğriler şeklinde görünen ardışık harfler okunabilir . Analiz yazılımı, flüoresans eğrileri ve dahil edilen nükleotid arasındaki yazışmayı mümkün kılar.
Bilgi elektronik olarak kaydedilir ve yorumlanan dizi bilgisayarın veri tabanında saklanır . Bu tür dizilemenin yüksek verimli olduğu söylenir çünkü aynı anda birçok dizi gerçekleştirilebilir. Aslında sıralayıcı modellerine bağlı olarak 1, 6, 12 ve hatta 36 kapiler paralel olarak çalışabilir, otomatın bir plakada bulunan 96 dizi reaksiyonunu kapilerlerin her birine art arda enjekte edebileceğini bilir. Oynatma uzunluğu, dizi başına yaklaşık 1 kb'dir. Bir dizinin çalışması için süre yaklaşık 10 dakikadır. Bir gecede, 12 kapiler ile, sıralayıcı otomatik olarak 1 Mb okuma elde edebilir.
Yeni nesil sıralama yöntemlerinin karşılaştırılmasıYöntem | Okuma uzunluğu | hassas | Deneyimle okuma | deneyim zamanı | 1 milyon baz başına maliyet (ABD doları cinsinden) | Faydaları | Dezavantajları |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Gerçek zamanlı tek molekül dizilimi (Pacific Biosciences) | ortalama 10.000 bp ila 15.000 bp (14.000 bp N50); maksimum okuma uzunluğu> 40.000 baz | %87 | hücre başına 50.000 veya 500-1000 megabaz | 30 dakika ila 4 saat | 0.13$– 0.60$ | uzun okumalar Hızlı. 4mC, 5mC, 6mA'yı algılar | orta düzeyde akış, ekipman çok pahalı olabilir |
İyon yarı iletken ( Sıralama İyon Torrent ) | 400 bp'ye kadar | %98 | 80 milyona kadar | 2 saat | 1 dolar | en ucuz, hızlı ekipman | homopolimer hataları |
Pyrosequencing ( 454 ) | 700 bp | %99.9 | 1 milyon | 24 saat | 10 $ | uzun, hızlı okumalar | deney pahalı, homopolimer hataları |
Sentez yoluyla sıralama (Illumina) | 50 ila 300 bp | %99.9 | 6 milyara kadar | 1 ila 11 gün | 0,05 ila 0,15 ABD Doları | Sıralayıcı modeline ve istenen uygulamaya bağlı olarak yüksek sıralı çıktı potansiyeli | Ekipman çok pahalı olabilir. Yüksek konsantrasyonlarda DNA gerektirir. |
Ligasyon dizilimi (SOLiD dizilimi) | 50 + 35 veya 50 + 50 bp | %99.9 | Yok | 20 dakika ila 3 saat | 2400 dolar | uzun okumalar Birçok uygulama için kullanışlıdır. | Büyük sıralama projeleri için daha pahalı ve elverişsiz. Bu yöntem ayrıca plazmit klonlama veya PCR adımı için zaman gerektirir. |
Soyadı | Makine sayısı (dünya çapında) |
---|---|
Illumina HiSeq 2000 | 5490 |
Illumina Genom Analiz Cihazı 2x | 411 |
kaya 454 | 382 |
ABI KATI | 326 |
İyon Torrenti | 301 |
Illumina MiSeq | 299 |
iyon protonu | 104 |
Pasifik Biyobilimleri | 50 |
Oxford Nano gözenekli MinION | 14 |
Illumina SonrakiSeq | 3 |
Nanopor dizilimi, DNA dizilimi için 1995'ten beri geliştirilmekte olan bir yöntemdir.
Bir nano gözenek, 1 nanometre mertebesinde bir iç çapa sahip küçük bir deliktir. Bazı gözenekli transmembran hücresel proteinler nanoteller gibi davranır, nanogözenekler de bir silikon parçasına biraz daha büyük bir delik (birkaç on nanometre) aşındırılarak yapılmıştır.
Nano gözenek dizilemesinin arkasındaki teori şu şekildedir: Bir nano gözenek iletken bir sıvıya daldırıldığında ve bunun üzerine bir potansiyel (voltaj) uygulandığında, iyonların nano gözenek boyunca iletilmesinden kaynaklanan bir elektrik akımı gözlemlenebilir. Akım miktarı, nanoporun boyutuna ve şekline çok duyarlıdır. Tek nükleotidler (bazlar), DNA iplikçikleri veya diğer moleküller nanoporun içinden veya yakınından geçerse, bu nanopordan geçen akımın büyüklüğünde karakteristik bir değişiklik yaratabilir.
Erken ikinci yarısında XX inci yüzyıl, insanların ilaç oranı hala organizasyona anlamak için irade ve tedavi hastalık ve çeşitli tehditlere hakim oldu. Bununla birlikte, özellikle farklı tekniklerin gelişmesi ve ortaya çıkması sayesinde, son yıllarda nasıl çalıştığına dair anlayış büyük ölçüde derinleşti. Daha çok patolojinin yokluğu anlamına gelen sağlık kavramı, doğal olarak bundan böyle bir bireyin hem fiziksel hem de ahlaki olarak genel olarak iyi olma hissi anlamına gelecek şekilde yeniden tanımlandı. Böylece, her bireye kendi fiziksel bütünlüğüne dikkat etme imkanı sunan yeni ticari stratejiler demokratikleşti. (tıbbi reçetesiz ilaçlar, sağlıklı yiyecekler vb.).
DNA dizilimi, sağlık kavramının ve genel olarak “canlılar”la olan ilişkinin bu yeniden tanımlanmasının tam kalbinde yer alan bir tekniktir, çünkü her insan için optimal ve kişiselleştirilmiş bir tedavi önerir. Genetik veri pazarı çok hızlı gelişti ve kurulduğu günden bu yana çok sayıda yatırım fiyatların keskin bir şekilde düşmesine izin verdi.
Bir insan genomunun ilk dizilemesidir 2003 yılında tamamlanmış ve 2.7 milyar $ toplam yatırım ile, etrafında çalışma on yıl almıştır. O zamanlar, Sanger yöntemi, DNA'mızı oluşturan yaklaşık 3 milyar çift nükleotidi deşifre etmek için hâlâ yoğun bir şekilde kullanılıyordu. Daha sonra birçok proje ortaya çıktı (özellikle 1000 Génomes , ENCODE …) ve yeni makineler (yukarıda bahsedilen) 1000 dolardan daha az bir fiyata bir insan genomunun tam dizisini üretmek amacıyla geliştirildi. Dizileme yöntemlerinin geliştirilmesiyle, yüksek kalitede bir insan genomunun kısmi dizilenmesinin fiyatı, 2003 yılında tamamlanan projeye göre nispeten daha ucuz olan 2006 yılında 14 milyon dolar olarak tahmin edilmiştir. tek galibiyet 1.500 dolar civarındaydı.
NGS kısaltması altında gruplanan, çok daha verimli , daha hızlı ve daha ucuz bu yeni yöntemlerin ortaya çıkmasıyla birlikte, DNA dizileme pazarı patlamış ve günümüzde çeşitli alanlarda birçok uygulama mevcuttur. Illumina gibi bazı şirketler artık bireylerin finansal olarak erişebileceği bir DNA dizileme hizmeti sunuyor.
DNA dizilimi , herhangi bir organizmanın tek tek genlerinin, büyük genetik bölgelerin, tam kromozomlarının veya tüm genomlarının dizisini belirlemek için kullanılabilir. DNA dizileme, biyolojinin ve tıp, adli tıp veya antropoloji gibi diğer bilimlerin birçok alanında kilit bir teknoloji haline gelmiştir .
Moleküler biyolojide, genom dizilimi kodlanmış proteinlerin çalışmasına izin verir , araştırmacılar genlerdeki değişiklikleri tanımlar ve potansiyel ilaçları hedeflemek için bunları belirli hastalıklarla ilişkilendirir.
Sıralama, normal hücre proliferasyonu, farklılaşması ve ölümü programlarını değiştiren kritik genlerdeki mutasyonların birikmesi nedeniyle ortaya çıkan belirli kanserlerin genetik kökenini anlamayı mümkün kılmıştır . RAS-RAF-MEK-ERK-MAP kinazı , büyüme sinyallerine hücresel tepkileri içerir ve insan kanserinin yaklaşık %15'inde RAS geni mutasyona uğrayarak onkojenik bir forma neden olur.
DNA, nesilden nesile aktarım açısından bilgilendirici bir makromolekül olduğundan, paleogenetyenler ve antropologlar arasındaki ortak çalışmalara dayanarak, evrimsel biyolojide DNA dizilimi, farklı organizmaların nasıl ilişki kurduğunu ve nasıl evrimleştiklerini incelemek için kullanılır. Nekropollerde gömülü, başta kemik ve diş olmak üzere insan dokularının DNA'sının analizi, haplogrupların tanımlanmasını ve biyocoğrafik kökenlerinin yanı sıra yüzlerce veya binlerce yıl önce alabilecekleri göç yollarını tahmin etmeyi , karşılaştırmayı mümkün kılar. genetik özelliklerini mevcut popülasyonlarınkilerle veya bazı fiziksel özelliklerini oluşturmak için. Genom dizilemenin fiyatındaki düşüş nedeniyle, şirketler, halka, evde kullanmak için basit bir kitten bir kişinin kökenini izlemeyi ücretli bir hizmet olarak sunuyor.
Tıbbi genetikçiler, genetik hastalık riski olup olmadığını belirlemek için hastalardaki genleri sıralayabilir. Kişinin genetik özelliklerinin incelenmesidir. Tanı genellikle doğum öncesi veya sonrasıdır. Örneğin, doğum öncesi teşhis, ciddi bir engelden veya davranışsal ve psikolojik bozukluklardan sorumlu kalıtsal bir hastalığı tespit edebilir ve çocuğuna teşhis konulan ebeveynlere hamileliği sürdürüp sürdürmeme seçeneği verebilir. Genetik varyasyonlar ( tek nükleotid polimorfizmleri ) hakkındaki bilgiler de terapötik yönetime rehberlik eder ve aile üyeleri için genetik danışmanlık yapılmasına olanak tanır.
Giderek artan bir şekilde, genetik özelliklerin incelenmesi, yüksek verimli DNA dizilimi (NGS) ile yapılır. Genel olarak şu anda, daha çok , mutasyonların 2/3'ünün tarif edildiği genlerin sadece kodlayan kısımları sekanslanır . Bu nedenle NGS, bir kişinin genlerinin tüm kodlayıcı kısımlarını bir kerede sıralamayı mümkün kılar, buna ekzom denir .
Doğum öncesi tanıda DPNI, Down sendromu veya diğer kromozomal anormallikler ve hatta belirli nokta mutasyonları için güvenli ve erken bir tespit tekniği olarak kurulmaktadır. Bu bir teşhis değil, sadece bir taramadır. Hamilelik sırasında anneden kan alınmasından oluşur. Bu kan doğal olarak fetüsten alınan az miktarda DNA parçası içerir ve genetikçiler onu anneye ait olan ve yine kanda bulunabilen DNA parçalarından ayıramazlar. Bu nedenle DPNI, anne kanında dolaşan tüm DNA parçalarının yüksek verimli bir dizilimi ve ardından sonuçların bir bilgisayar analizidir. DPNI, İnvaziv Olmayan Teknikle Prenatal Tarama anlamına gelir. Sonuçlara bağlı olarak, amniyosentez içeren anormalliğin doğrulanması belirtilir .
Üreme tıbbı, üreme fizyolojisinin yanı sıra patolojisi, kısırlığını inceleyen tıp dalıdır. Tıbba bu yaklaşım üreme sağlığını iyileştirmeyi amaçlar.
Özellikle cinsiyet hücrelerinin DNA dizilimi, doğurganlıkta dengesizliğe neden olan genetik modifikasyonların anlaşılmasını mümkün kılmıştır. Gelecekteki genetik tedavilerin kalıtsal hastalıkları önlemeye yönelik olduğu düşünülmektedir, örneğin trizomi 21, döllenme sırasında X kromozomunun inaktivasyonundan sorumlu bir genin ekspresyonunun olmamasından kaynaklanmaktadır . Bununla birlikte, üreme için DNA'nın işlenmesiyle ilgili biyoetik sorular ortaya çıkmaktadır.
Yüksek verimli dizileme, tıbbi mikrobiyoloji alanına da girmiştir. Örneğin bakteriyolojide, farklı hastalardan alınan iki numunede aynı bakteri türü (örneğin Staphylococcus aureus ) bulunabilse bile, bu mutlaka hastadan hastaya doğrudan bir bulaşma değildir. Aslında, aynı bakteri türü altında çok farklı birçok suş gruplandırılmıştır ve bu nedenle farklı genomlara sahiptir. Tüm genom dizilimi, örneğin, organizmalar arasındaki mutasyonların ( SNP'ler ) sayısını belirleyerek bu genomların ne kadar farklı olduğunu belirlemeyi mümkün kılar . Bir bakterinin bir hastadan diğerine doğrudan geçişi sırasında, farklı mutasyonların sayısı bu nedenle çok düşüktür.
Genel olarak, tüm bakteri genomlarının yüksek verimli dizilimi aşağıdakiler için faydalı olabilir:
Bir kişinin DNA'sı nesnelere veya insanlara temas yoluyla aktarılabilir. Bu DNA, farklı matrislerden, kandan, spermden, saç elementlerinden, epitel hücrelerinden gelen hücrelerden gelir. (DNA dizilemesi, adli kimlik ve babalık testi için DNA profilleme yöntemleriyle kullanılabilir. Ancak, bir babalık testinin Fransa'da yasal bir değeri olmadığını, ancak bir yargıç tarafından emredilmiş olması halinde not edilmelidir.